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炎癥是指身體對刺激的機械、生化或免疫介導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，過度活躍性炎癥反應(yīng)是有害的，長時間的炎癥過程不僅會干擾受損組織的修復(fù)過程，還會引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，這些級聯(lián)反應(yīng)與炎癥細(xì)胞持續(xù)募集到病變附近并形成局部炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴有關(guān)，這兩種情況最終都會阻礙組織修復(fù)并加劇退變。可注射水凝膠微球具有延長藥物半衰期，保持局部藥物有效濃度等優(yōu)點，已在臨床藥物載體應(yīng)用中表現(xiàn)出了巨大的潛力，但退行性疾病中的局部過度活躍性炎癥可能會影響這一治療效果。

近期，來自蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的陳亮教授、顧勇教授與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的崔文國教授團(tuán)隊合作在Nano Letters雜志上發(fā)表了題目為“Modulation of Local Overactive Inflammation via Injectable Hydrogel Microspheres ”的研究性論文，作者通過在甲基丙烯酰化明膠（GelMA）上共價偶聯(lián)APETx2并進(jìn)一步負(fù)載髓核細(xì)胞來構(gòu)建可注射的“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球，既能抑制局部炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴，又實現(xiàn)了在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的代謝平衡，為過度活躍性炎癥反應(yīng)下的組織修復(fù)與再生提供了一種有效的途徑。

圖1 文章原理圖，在GelMA上偶聯(lián)APETx2并進(jìn)一步負(fù)載髓核細(xì)胞來構(gòu)建可注射的“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球，該微球可抑制局部過度活躍性炎癥并維持ECM穩(wěn)定。

微流控技術(shù)是構(gòu)建水凝膠微球的理想平臺。它不僅可以同時裝載藥物和細(xì)胞，而且操作簡便，通過與活性肽APETx2共價偶聯(lián)并進(jìn)一步攜帶髓核細(xì)胞，即可構(gòu)建出“肽-細(xì)胞-水凝膠”凝膠微球。如圖2所示.：通過微流控同步光交聯(lián)裝置制備GelMA微球（GM）后清洗并冷凍干燥后制備出多孔GelMA微球；制備APETx2共軛多孔GelMA微球(GA)并負(fù)載髓核細(xì)胞，在椎間盤（IVD）退變的大鼠模型中注射“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球(GNA)；“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球調(diào)節(jié)了大鼠IVD退變部位的過度活躍性炎癥，并促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖與IVD的再生。

圖2 可注射“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球調(diào)節(jié)局部過度活躍性炎癥來促進(jìn)椎間盤再生的示意圖。

凝膠微球通過微流控裝置中的油包水方法形成，并進(jìn)一步光交聯(lián)和冷凍干燥以獲得多孔凝膠微球。如視頻1所示，在顯微鏡下觀察，同軸噴嘴同向剪切制備的凝膠微球分散性好，大小均勻，微球可以順利地穿過微型注射器的針頭，而不會損壞結(jié)構(gòu)。

視頻1 微球順利通過微型注射器的針頭，沒有損壞結(jié)構(gòu)。

為了賦予髓核細(xì)胞調(diào)節(jié)局部過度活躍性炎癥反應(yīng)的能力，微球表面的羧基被EDC/NHS激活，然后共價連接到APETx2上的氨基殘基上，形成APETx2-GelMA微球（即GA）。接下來，通過圖3的XPS分析和傅里葉變換紅外光譜分析，表明APETx2肽接枝成功且SEM表明GA保留了GM的多孔結(jié)構(gòu)。糖酵解是椎間盤能量供應(yīng)的主要形式，逐漸積累的乳酸在退行性椎間盤中產(chǎn)生酸性微環(huán)境。因此，研究人員通過高效液相色譜法研究了在兩種酸堿度條件下(7.4和6.5)赤霉素的釋放行為，在pH 6.5條件下肽的釋放速率比pH 7.4條件下高，但兩者之間無顯著差異。

圖3 可注射“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球（GNA）相關(guān)的表征。（A、B）SEM觀察GM與GA微球的微觀形貌差異；（C-F）GM與GA微球的XPS分析與傅里葉變換紅外光譜；（G-H）微球接枝FITC-BSA前后的熒光圖像,以及在pH7.4和pH6.5下，GA釋放APETx2的釋放曲線。

此外，在體外酸性環(huán)境中，研究人員檢測了相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平。如圖4所示，谷氨酸組的ASIC-3蛋白表達(dá)受到顯著抑制，與對照組無顯著差異。炎癥細(xì)胞因子白介素-1β、白介素-6和腫瘤壞死因子-α，也被APETx2顯著抑制。與此同時，APETx2下調(diào)MMP-3和ADAMATS-5的表達(dá)，從而減少由NPCs合成的細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)含量的增加，COL2和聚集蛋白聚糖蛋白的高表達(dá)也證明了這一點。以上結(jié)果表明，APETx2可以抑制ASIC-3的激活，減少酸性環(huán)境引起的椎間盤炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴。此外，APETx2可逆轉(zhuǎn)酸性環(huán)境下髓核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的合成/分解代謝失衡，導(dǎo)致髓核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加，抑制椎間盤退變。

圖4 髓核細(xì)胞在體外酸性炎癥微環(huán)境中7天的蛋白和基因的表達(dá)。（A）ASIC-3、炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)印跡。（B-I）RT-PCR半定量測定ASIC-3、炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的基因表達(dá)。

為了研究GNA促進(jìn)IVD體內(nèi)再生的作用，研究人員將將富含髓核細(xì)胞的GA (GNA)注射到大鼠IVD退變模型中。如圖5影像學(xué)結(jié)果表明，調(diào)節(jié)局部炎性微環(huán)境或單獨補充髓核細(xì)胞可以延緩椎間盤退變，但不能逆轉(zhuǎn)退變的椎間盤。另一方面，“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球不僅保持和恢復(fù)了髓核細(xì)胞中的高含水量，而且在延緩?fù)俗冞^程的同時促進(jìn)了退變椎間盤的再生。

圖5 動物實驗的影像學(xué)數(shù)據(jù)。(A)大鼠尾椎穿刺模型的建立。(B)第4周和第8周大鼠尾椎骨的代表性x光圖像。（C-E)第4周和第8周各組DHI百分率的變化。(F)大鼠尾椎骨的代表性核磁共振圖像。(G)各組在第4周和第8周的磁共振分級變化。

術(shù)后4周和8周收集組織切片做進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖6所示：與正常對照組相比，蘇木精伊紅和番紅O-Fast Green染色顯示GNA組椎間盤組織變性和結(jié)構(gòu)性損傷有所改善。此外，在髓核和纖維環(huán)之間有清晰和明確的邊界，并且髓核的含量在8周時顯著改善。然而，在DC、GA和GN組中，椎間盤的髓核隨著椎間盤突出而逐漸破裂,髓核和纖維環(huán)之間的邊界越來越模糊。這些結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色的進(jìn)一步研究結(jié)果一致。GNA組的COL2含量在第8周完全恢復(fù)，而組織學(xué)評分顯示GNA組的膠原含量在第4周顯著高于DC、GA和GN組，但低于正常對照組。GNA組膠原含量在第8周恢復(fù)，與正常對照組無顯著性差異，表明“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球具有促進(jìn)退變椎間盤再生的作用。

圖6 動物實驗的組織學(xué)評價。(A)4周和8周大鼠椎間盤的蘇木精-伊紅染色圖像。(B)番紅O-固綠染色。(D-F)COL2免疫組織化學(xué)染色。各組第4周和第8周組織學(xué)分級的變化。

綜上所述，該研究通過微流控技術(shù)制備了與APETx2共價接枝并攜帶髓核細(xì)胞的多孔“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球，并證實了這種新的“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球除了參與組織再生過程，還可以調(diào)節(jié)局部過度活躍性性炎癥反應(yīng)，以維持椎間盤髓核中細(xì)胞外基質(zhì)的合成/分解代謝平衡。這種可注射的“肽-細(xì)胞-水凝膠”微球為實現(xiàn)局部過度活躍性性炎癥反應(yīng)微環(huán)境下的組織再生提供了新的思路。